近期已經證明(míng)，細胞外(wài)囊泡 (EV) 攜帶 DNA。然而，EV中 DNA (EV-DNA) 的許多基本特征仍然難以捉摸。
2022年4月4日，廈門(mén)大(dà)學顔曉梅團隊在Journal of Extracellular Vesicles（IF=26）在線發表題爲“Analysis of extracellular vesicle DNA at the single-vesicle level by nano-flow cytometry”的研究論文(wén)，該研究通過納米流式細胞儀 (nFCM) 可以檢測直徑小(xiǎo)至 40 nm 的單個 EV 和(hé) SYTO 16 染色後 200 bp 的單個 DNA 片段，用(yòng)于研究單個囊泡處的 EV-DNA。
通過同時(shí)對(duì)單個顆粒進行側向散射和(hé)熒光 (FL) 檢測并結合酶處理(lǐ)，本研究表明(míng)：(1) 裸 DNA 或與非囊泡實體相關的 DNA 大(dà)量存在于由細胞培養物制備的 EV 樣品中（超速離心培養基）；(2) 單個 EVs 中 EV-DNA 的數量表現(xiàn)出很(hěn)大(dà)的異質性，DNA 陽性 (DNA+) EVs 的數量在 30% 到(dào) 80% 之間變化，具體取決于細胞類型；(3) 外(wài)部 EV-DNA 主要定位在相對(duì)較小(xiǎo)的 EVs 上(shàng)（例如，HCT-15 細胞系 <100 nm），外(wài)部 DNA+ EVs 的分泌可以通過抑制外(wài)泌體分泌途徑顯著減少；(4) 内部 EV-DNA 主要封裝在相對(duì)較大(dà)的 EV 的管腔内（例如 HCT-15 細胞系爲 80-200 nm）；(5) 雙鏈 DNA (dsDNA) 是外(wài)部和(hé)内部 EV-DNA 的主要形式；(6) EVs 中未發現(xiàn)組蛋白(bái) (H3)，EV-DNA 與組蛋白(bái)不相關，(7) 基因毒性藥物誘導 DNA+ EVs 的釋放(fàng)增加，外(wài)部DNA+ EVs和(hé)内部DNA+ EVs的數量以及單個EVs中的DNA含量均顯着增加。這(zhè)項研究爲深入了(le)解 DNA 與EV的關聯提供了(le)直接和(hé)确鑿的實驗證據。
細胞外(wài)囊泡 (EVs) 是由幾乎所有細胞類型分泌的納米級膜囊泡，通過将蛋白(bái)質、核酸和(hé)脂質從(cóng)供體細胞轉移到(dào)受體細胞來(lái)介導細胞間通訊。研究表明(míng)，EV中存在基因組 DNA、線粒體 DNA 甚至病毒 DNA。通過 DNA 的包裝和(hé)水(shuǐ)平轉移，EV 在維持細胞穩态、調節免疫反應和(hé)調節腫瘤進展方面發揮着重要的作(zuò)用(yòng)。
基于 EV 中的 DNA (EV-DNA) 開(kāi)發了(le)用(yòng)于腫瘤診斷的液體活檢測試。盡管已經認識到(dào) EV-DNA 的生物學意義，但(dàn)對(duì) EV-DNA 的探索較少，許多基本特征仍存在争議(yì)，例如 DNA 是否與所有或部分 EV 亞群相關？EV-DNA 是否位于内腔和(hé)/或 EV 表面？DNA含量和(hé)EV大(dà)小(xiǎo)之間有什(shén)麽關系？EV-DNA 是單鏈 DNA (ssDNA) 還是雙鏈 DNA (dsDNA)？對(duì) EV-DNA 的研究通常通過從(cóng) EV 分離物中提取 DNA，然後進行豐度、片段長度和(hé)序列評估來(lái)進行。通過将 DNase 酶消化與 Fragment Analyzer 系統相結合，研究了(le) DNA 的相對(duì)豐度和(hé)定位（管腔内或與 EV 表面相關）。爲了(le)闡明(míng) EV-DNA 在 EV 亞群之間的異質性，對(duì)分離的 EV 進行 DNA 分析通過密度梯度離心或不對(duì)稱流場-流分餾已經進行。盡管批量分析能(néng)夠識别不同 EV 亞群中的 DNA，但(dàn)結果可能(néng)存在争議(yì)，因爲 EV-DNA 無法與無細胞 DNA 區(qū)分開(kāi)來(lái)。由于 EV 的大(dà)小(xiǎo)和(hé)貨物含量差異很(hěn)大(dà)，因此迫切需要單粒子技術來(lái)破譯 EV-DNA 的内在異質性，并将 EV-DNA 與遊離 DNA 或其他(tā)污染物區(qū)分開(kāi)來(lái)。然而，EV 的納米級粒徑（大(dà)多數大(dà)小(xiǎo) <100 nm）和(hé) EV-DNA 的低(dī)含量使其成爲一個挑戰。
在過去的十年中，研究人員一直緻力于開(kāi)發一種高(gāo)靈敏度的納米流式細胞儀。它已實現(xiàn)對(duì)單個 EV、病毒、二氧化矽納米粒子和(hé)金(jīn)納米粒子的光散射檢測，分别小(xiǎo)至 40、27、24 和(hé) 7 nm。對(duì)于熒光 (FL) 檢測，檢測到(dào)單個 R-藻紅(hóng)蛋白(bái)分子的信噪比爲 17，有機染料的檢測限确定爲三個 Alexa Fluor 532 分子。
在本研究中，嘗試通過将酶消化與 nFCM 相結合，在單囊泡水(shuǐ)平上(shàng)分析外(wài)部和(hé)内部 EV-DNA。研究了(le) DNA+ EV 的百分比以及 DNA 含量分布與 EV 大(dà)小(xiǎo)、ssDNA 和(hé) dsDNA 之間的區(qū)别、EV-DNA 和(hé)組蛋白(bái)的關聯以及抗癌藥物治療後 DNA 含量的改變。通過同時(shí)對(duì)單個顆粒進行側向散射和(hé)熒光 (FL) 檢測并結合酶處理(lǐ)，本研究表明(míng)：(1) 裸 DNA 或與非囊泡實體相關的 DNA 大(dà)量存在于由細胞培養物制備的 EV 樣品中（超速離心培養基）； (2) 單個 EVs 中 EV-DNA 的數量表現(xiàn)出很(hěn)大(dà)的異質性，DNA 陽性 (DNA+) EVs 的數量在 30% 到(dào) 80% 之間變化，具體取決于細胞類型； (3) 外(wài)部 EV-DNA 主要定位在相對(duì)較小(xiǎo)的 EVs 上(shàng)（例如，HCT-15 細胞系 <100 nm），外(wài)部 DNA+ EVs 的分泌可以通過抑制外(wài)泌體分泌途徑顯著減少； (4) 内部 EV-DNA 主要封裝在相對(duì)較大(dà)的 EV 的管腔内（例如 HCT-15 細胞系爲 80-200 nm）； (5) 雙鏈 DNA (dsDNA) 是外(wài)部和(hé)内部 EV-DNA 的主要形式； (6) EVs 中未發現(xiàn)組蛋白(bái) (H3)，EV-DNA 與組蛋白(bái)不相關，(7) 基因毒性藥物誘導 DNA+ EVs 的釋放(fàng)增加，外(wài)部DNA+ EVs和(hé)内部DNA+ EVs的數量以及單個EVs中的DNA含量均顯着增加。這(zhè)項研究爲深入了(le)解 DNA 與EV的關聯提供了(le)直接和(hé)确鑿的實驗證據。
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jev2.12206
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