爲何要檢測内毒素 圖片

爲内毒素無處不在

内毒素又稱爲脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，分子量範圍爲3,000至4,000Da，由長鏈複合多糖尾部和(hé)疏水(shuǐ)脂質基團組成（圖1）），是大(dà)多數格蘭氏陰性菌細胞壁的組成部分，具有較高(gāo)的熱穩定性。當細菌在活躍生長或在死亡分解時(shí)，細胞壁中的脂多糖就被釋放(fàng)到(dào)周圍環境中。

圖1.脂多糖結構。内毒素爲複合脂多糖，是革蘭氏陰性細菌細胞壁的活性結構成分。它們由核心寡糖鏈、O-特異性多糖側鏈（O-抗原）和(hé)脂質組分（脂質A）組成。

使用(yòng)如大(dà)腸杆菌(E.coli)生産的重組蛋白(bái)，或者提取革蘭氏陰性菌内的核酸時(shí)經常遇到(dào)内毒素污染問題。内毒素污染的蛋白(bái)質/抗體/核酸在轉染入細胞中或者注入到(dào)動物體内時(shí)，可引發強烈的免疫反應，導緻全身性炎症反應綜合征（SIRS）和(hé)/或敗血症。因此，内毒素的去除對(duì)于人類疾病治療的注射型藥品、生物制品等都是必須的，尤其對(duì)于基因藥物、蛋白(bái)藥物、抗體藥物、疫苗等生物制品的下(xià)遊純化處理(lǐ)來(lái)說就顯得非常重要。

中國藥典的規定

細菌内毒素檢查法（通則 1143）包括兩種方法：凝膠法和(hé)光度測定法，後者又包括濁度法和(hé)顯色法，可以選用(yòng)其中任何一種方法進行細菌内毒素檢查。凝膠法和(hé)光度法各具優點和(hé)局限：

凝膠法

凝膠法的優點是操作(zuò)簡便，供試品在排除幹擾作(zuò)用(yòng)後均可使用(yòng)凝膠法進行檢驗。

凝膠法的幹擾試驗是确定供試品能(néng)否使用(yòng)凝膠法的決定因素。進行幹擾實驗時(shí)，應挑選與鲎試劑反應呈陰性的樣品進行幹擾試驗。若樣品稀釋到(dào) MVD(有效稀釋倍數) 仍不能(néng)排除幹擾作(zuò)用(yòng)，應進一步對(duì)供試品的前處理(lǐ)進行研究，再用(yòng)幹擾試驗驗證能(néng)否使用(yòng)凝膠法。

光度法

光度法（包括濁度法和(hé)顯色法）可定量檢測内毒素的含量，能(néng)較爲準确評估産品在生産過程中污染的相對(duì)風(fēng)險，定量檢測的數據不僅有利于追蹤産品質量趨勢，還能(néng)起到(dào)風(fēng)險預警的作(zuò)用(yòng)，更易達到(dào)數據完整性的要求。

由于光度法的檢測限範圍比凝膠法寬，使得有幹擾的樣品可以有更大(dà)的稀釋倍數，對(duì)于部分使用(yòng)凝膠法無法排除幹擾的樣品，可以嘗試使用(yòng)光度法建立細菌内毒素檢測方法。

常用(yòng)實驗方法和(hé)幹擾分析

鲎試劑是從(cóng)海洋動物鲎提取的血細胞溶解物,是檢測革蘭氏陰性細菌内毒素的一種敏感試劑。其實驗原理(lǐ)如圖2所示：

圖2.鲎試劑的級聯反應。LPS（内毒素）激活質膜結合因子C。活化的因子C激活因子B，活化的因子B激活凝固酶原，生成凝血酶。加入顯色底物Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA後，活化的蛋白(bái)酶-凝血酶催化對(duì)硝基苯胺（pNA）的釋放(fàng)，産生黃色。通過測量405nm處吸光度值進行定量。根據标準曲線可推算(suàn)得出結果。紅(hóng)色表示無活性酶，綠色表示活性酶。

通常實驗流程：

Thermo提供光度法内毒素定量試劑 (A39552）。那麽試劑的品質如何？我們将從(cóng)靈敏度、數據重複性、抗幹擾性等幾個角度對(duì)Pierce内毒素定量試劑盒的性能(néng)進行驗證：

數據靈敏度和(hé)重複性

提供兩個線性動态範圍：0.01-0.1 EU/mL和(hé)0.1-1.0 EU/mL（圖3）。使用(yòng)此試劑盒的實驗-實驗和(hé)操作(zuò)者-操作(zuò)者差異系數（CV）爲3%。靈敏度高(gāo)可以有效地避免内毒素定量中潛在的假陰性或者假陽性。

圖3.Pierce内毒素定量試劑盒的标準曲線。标準曲線顯示出優異的線性度，r2= 0.99。Pierce顯色法内毒素定量試劑盒的較低(dī)标準曲線範圍爲0.01-0.1 EU/mL。0.1–1.0 EU/mL标準曲線表示使用(yòng)内毒素标準品和(hé)阿米巴樣細胞裂解物培養14分鐘(zhōng)，随後使用(yòng)顯色底物培養6分鐘(zhōng)。對(duì)于較低(dī)濃度，使用(yòng)内毒素标準品和(hé)阿米巴樣細胞裂解物培養30分鐘(zhōng)，随後使用(yòng)顯色底物培養6分鐘(zhōng)。低(dī)濃度标準品（0.01-0.1 EU/mL）顯示出了(le)一緻性和(hé)再現(xiàn)性（n = 17；CV = 3%）。

兼容性

鲎試劑可能(néng)受許多因素影響，造成假陰性或假陽性。包括：

i. 反應溫度、樣品酸堿度、離子強度和(hé)金(jīn)屬離子（如鎂和(hé)鈣）

ii. 血清蛋白(bái)、核酸、脂肪酸、表面活性劑和(hé)螯合劑（如EDTA和(hé)肝素）可引起内毒素分子結構的變化

iii. (1-3)-β-D-葡聚糖的非特異性幹擾：鲎試劑會(huì)與其反應，造成假陽性結果

表1.使用(yòng)Pierce顯色法内毒素定量試劑盒，獲得有效内毒素檢測結果所兼容的高(gāo)濃度。所列出的濃度是指樣品中添加0.5 EU内毒素時(shí)，未使定量值降低(dī)的實際濃度。以比例的形式表示稀釋濃度，其中1:100表示100倍稀釋

需要指出的是：Pierce顯色法内毒素定量試劑盒（貨号A39552）與β-葡聚糖兼容，并且在含有10ng/ mL（1,3）-β-D-葡聚糖的樣品中，未顯示出增強作(zuò)用(yòng)。

内毒素去除

超濾、多粘菌素B親和(hé)樹脂以及基于樹脂或膜的色譜法是内毒素去除的傳統方法，這(zhè)些(xiē)方法在蛋白(bái)回收率、内毒素結合能(néng)力等方面具有局限性，有的甚至本身具有毒。

Thermo Fisher Scientific提供高(gāo)載量内毒素去除樹脂(88270)，是基于ε-聚賴氨酸親和(hé)樹脂（天然賴氨酸的聚合物），顯示出内毒素結合能(néng)力和(hé)蛋白(bái)質回收率：

➤ 結合力可以達到(dào)2,000,000 EU/mL

➤ 在處理(lǐ)初始内毒素水(shuǐ)平爲10,000 EU/mL的樣品時(shí)，去除效率可以達到(dào)99%以上(shàng)

圖4.采用(yòng)Pierce高(gāo)通量内毒素去除樹脂去除内毒素的效率。（A）内毒素去除和(hé)定量的工(gōng)作(zuò)流程。（B）測定和(hé)去除蛋白(bái)質樣品中的内毒素以備下(xià)遊應用(yòng)。