在《Biacore檢測蛋白(bái)與小(xiǎo)分子相互作(zuò)用(yòng)的常見問題（上(shàng)）》中我們着重介紹了(le)在實驗設計(jì)以及樣品準備方面的問題，在本文(wén)的下(xià)篇中，我們還是從(cóng)智荟專線收集的客戶咨詢出發，将繼續讨論在實驗進行過程中和(hé)最終的數據分析階段可能(néng)遇到(dào)的常見問題，并逐一揭開(kāi)上(shàng)篇中遺留的各個懸念……

一、 關于溶劑校正的問題

溶劑校正流程貫穿于前期的樣品準備、之後的樣品檢測以及最後的數據分析，是檢測蛋白(bái)與小(xiǎo)分子相互作(zuò)用(yòng)實驗中非常關鍵的一個步驟，也(yě)是Biacore檢測蛋白(bái)與小(xiǎo)分子互作(zuò)的一大(dà)優勢。

什(shén)麽情況下(xià)需要進行溶劑校正？

當運行緩沖液中含有高(gāo)折光率（refractive index）的成分，且此時(shí)在活通道(dào)上(shàng)的配體量較高(gāo)時(shí)，運行緩沖液流經活性通道(dào)時(shí)會(huì)存在一定的體積排阻效應，導緻活性通道(dào)與參比通道(dào)上(shàng)的信号存在差異[1]（如下(xià)圖1所示）。

1. 運行緩沖液的高(gāo)折光率與高(gāo)偶聯造成活性通道(dào)與參比通道(dào)的信号差異[1]。

如果運行緩沖液以及不同濃度的分析物樣品的折光率能(néng)保持嚴格一緻，則上(shàng)述的通道(dào)間差異也(yě)是一個定值了(le)，将不會(huì)對(duì)最終互作(zuò)結果産生影響；然而實際情況下(xià)，由于樣品配制誤差等原因，緩沖液與分析物樣品間的折光率誤差往往難以避免。以DMSO爲例，1% DMSO的加入會(huì)導緻響應值信号上(shàng)升約1200 RU[1]，而小(xiǎo)分子分析物本身與配體結合産生的響應值是較小(xiǎo)的，因此DMSO濃度的微小(xiǎo)變化也(yě)會(huì)引起顯著的影響。此時(shí)就需要進行溶劑校正，來(lái)修正這(zhè)種由于高(gāo)折光率物質（例如DMSO等）濃度的細微偏差導緻的響應值信号顯著變化，得到(dào)最準确的互作(zuò)數據。

2如何進行溶劑校正？

以最常見的DMSO爲例，溶劑校正的核心思路是設置一系列含有不同濃度DMSO的校正溶液，濃度範圍覆蓋實驗中所用(yòng)的DMSO濃度（例如運行緩沖液和(hé)分析物樣品中均含5% DMSO，則校正溶液中濃度範圍可以是4.5% - 5.8%），以此來(lái)包含樣品與buffer配制過程中引入的DMSO濃度的誤差。使校正溶液按照濃度順序（從(cóng)低(dī)到(dào)高(gāo)或者從(cóng)高(gāo)到(dào)低(dī)）依次進樣，流經參比通道(dào)與活性通道(dào)後，以參比通道(dào)的響應值爲橫坐(zuò)标、活性通道(dào)扣減參比通道(dào)的響應值爲縱坐(zuò)标進行作(zuò)圖，得到(dào)溶劑校正曲線（如下(xià)圖2所示）。根據樣品在參比通道(dào)的信号，就可以通過校正曲線對(duì)應得到(dào)活性通道(dào)扣減參比通道(dào)的校正值。而此過程在Biacore上(shàng)，都是全自(zì)動完成的，有專用(yòng)向導式程序指引，無需手動操作(zuò)。

2. 典型的溶劑校正曲線示意圖[1]。

3

如何判斷溶劑校正的結果是否正常？

如果按照上(shàng)述的例子，對(duì)含有5% DMSO的樣品以4.5% - 5.8%的範圍進行溶劑校正，最終得到(dào)的溶劑校正曲線橫坐(zuò)标範圍一般要落在-500 到(dào) +1000 RU，校正曲線圖譜中的兩條豎線代表的是分析物中DMSO濃度範圍，要求落在校正曲線的範圍内，并且拟合的Chi²值小(xiǎo)于2[1][2]。

如果溶劑校正的結果出現(xiàn)異常，可以留意以下(xià)幾方面的問題：（1）建議(yì)使用(yòng)高(gāo)品質的DMSO試劑，并且使用(yòng)相同來(lái)源的DMSO溶解小(xiǎo)分子和(hé)配制所需溶液。（2）注意校正溶液的配制策略，例如隻需配制含4.5%和(hé)5.8% DMSO的這(zhè)兩種緩沖液，中間梯度通過這(zhè)兩種溶液按照不同比例混合得到(dào)，而不需要一個個單獨配制。（3）由于DMSO具有吸潮的性質，在配制過程中應及時(shí)封閉，避免長時(shí)間敞口放(fàng)置；在上(shàng)機檢測時(shí)，也(yě)應該對(duì)樣品管進行密封。爲此，Biacore獨特的全密閉樣品艙設計(jì)，及配套專用(yòng)的孔闆封膜及EP管橡膠蓋就派上(shàng)用(yòng)場了(le)。

關于溶劑校正步驟的具體操作(zuò)方法，可以掃描文(wén)末二維碼，查閱《Easy Biacore: T200 檢測蛋白(bái)與小(xiǎo)分子結合》中的相關内容。

二、結果分析中的相關問題

正确的溶劑校正是後續進行數據分析的前提，得到(dào)最終可分析的結果後，可能(néng)還面臨下(xià)面這(zhè)些(xiē)問題。

1

應該選擇哪種拟合模式？

關于拟合模式的選擇，是選擇動力學（Kinetics）分析還是親和(hé)力（Affinity）分析，主要是根據響應值圖譜的形狀來(lái)判斷的。對(duì)于動力學分析，要求響應值圖譜在結合和(hé)解離階段均展現(xiàn)出足夠的曲率（“慢結合慢解離”），而親和(hé)力分析則要求在每次的分析物進樣階段均達到(dào)穩态（steady state）。對(duì)于同時(shí)滿足兩種要求的響應值圖譜，理(lǐ)論上(shàng)兩種分析模式均可以使用(yòng)。關于不同響應值圖譜形狀以及可選的拟合模式，可參考如下(xià)圖3[3]。

3. 不同形狀的響應值圖譜與适用(yòng)的拟合模式的對(duì)應關系示意圖[3]。

如同在上(shàng)篇所提到(dào)的，蛋白(bái)與小(xiǎo)分子的相互作(zuò)用(yòng)在大(dà)部分情況下(xià)是“快(kuài)結合快(kuài)解離”的，在結合與解離階段的曲線未能(néng)呈現(xiàn)足夠的曲率，而在每次分析物進樣後，曲線快(kuài)速上(shàng)升并達到(dào)平台，因此适用(yòng)于親和(hé)力（Affinity）分析。而在解離階段曲線快(kuài)速下(xià)降至接近基線的特點，也(yě)使得蛋白(bái)與小(xiǎo)分子互作(zuò)檢測中一般不需要設置額外(wài)的再生步驟。

2

如何判斷拟合結果的好(hǎo)壞？

這(zhè)是很(hěn)多實驗者在面對(duì)自(zì)己的實驗結果時(shí)會(huì)發出的“靈魂拷問”，同樣也(yě)是Biacore另一個獨特優勢體現(xiàn)之處：具有智能(néng)數據質量評估系統，能(néng)夠以圖形化顯示方式來(lái)評估檢測結果。能(néng)夠對(duì)檢測結果自(zì)動進行統計(jì)學分析，并給出相應參數，以此判斷數據可信度與準确度。由于篇幅有限，我們這(zhè)裏主要讨論蛋白(bái)與小(xiǎo)分子互作(zuò)常用(yòng)的親和(hé)力分析結果的評價。

是使用(yòng)Biacore結果分析軟件得到(dào)的典型的親和(hé)力分析結果，在Report界面，顯示的參數有KD（以M爲單位）、Rmax、offset以及Chi²，相應的判斷标準如下(xià)：

1

拟合得出的KD值（即拟合曲線中豎線所在的橫坐(zuò)标值）應該盡可能(néng)落在分析物濃度範圍之内，最好(hǎo)在最高(gāo)濃度的一半以内。

2

當拟合得到(dào)的實際Rmax值顯著高(gāo)于理(lǐ)論計(jì)算(suàn)值時(shí)，說明(míng)結合反應未按照1：1的化學計(jì)量比進行，有可能(néng)出現(xiàn)了(le)非特異性結合或者分析物分子的聚集。對(duì)于小(xiǎo)分子樣品來(lái)說，往往由于溶解度等問題發生聚集導緻上(shàng)述現(xiàn)象。而造成拟合得到(dào)的實際Rmax值低(dī)于理(lǐ)論計(jì)算(suàn)值的原因，主要還是偶聯的配體中有一定比例的分子未充分暴露結合活性。如果上(shàng)述兩種情況同時(shí)存在，此時(shí)僅通過Rmax值難以判斷，需要通過其他(tā)實驗結果來(lái)驗證。

3

offset代表的是零濃度時(shí)的響應值，這(zhè)個值應該趨近于0；如果出現(xiàn)了(le)異常高(gāo)的值或者負值，需要檢查參比通道(dào)和(hé)零濃度的響應值 [3] 。

4

Chi²值反映了(le)拟合結果與實驗數據的接近程度，這(zhè)個值越小(xiǎo)，代表實驗結果與拟合模型越接近。

4. Biacore分析軟件中典型的親和(hé)力拟合結果界面 [2] 。

3

 關于非特異性吸附的問題

非特異性吸附的來(lái)源是多樣的，最常見的應該是分析物分子在參比通道(dào)芯片表面的吸附，其次可能(néng)還來(lái)源于分析物樣品中其他(tā)雜(zá)質成分在參比通道(dào)或者配體上(shàng)的非特異性結合，甚至還可能(néng)是分析物分子在配體上(shàng)的吸附（例如小(xiǎo)分子在配體蛋白(bái)非活性位點的弱結合等）。要判斷是否存在非特異性吸附，最主要的判斷依據是看(kàn)Binding to reference這(zhè)部分參數，該參數反映了(le)每個循環的分析物在參比通道(dào)上(shàng)的吸附情況。作(zuò)爲建議(yì)，可以按照以下(xià)标準判斷：如果Binding to reference的值大(dà)于活性通道(dào)扣減參比通道(dào)（如Fc=2-1）得到(dào)信号值的20%，則可以認爲存在較顯著的非特異性吸附。

要解決非特異性吸附問題，主要可以從(cóng)以下(xià)三方面入手：

1

改變芯片表面或者分析物的性質。比較直接的方法是調換配體與分析物的位置，即固定會(huì)發生非特異性吸附的原分析物，将原配體作(zuò)爲分析物流經芯片表面進行分析。然而在蛋白(bái)與小(xiǎo)分子的互作(zuò)實驗中，固定小(xiǎo)分子會(huì)面臨諸多問題（如上(shàng)篇中所述），因此這(zhè)個方案在解決小(xiǎo)分子的非特異性吸附中不常用(yòng)。其次可以考慮改變參比通道(dào)的處理(lǐ)方法。在使用(yòng)CM系列芯片偶聯配體進行檢測時(shí)，參比通道(dào)可以不作(zuò)任何處理(lǐ)，也(yě)可以進行活化與封閉。這(zhè)兩種處理(lǐ)方式下(xià)的芯片表面性質有所不同，改變處理(lǐ)方式或許可以減弱非特異性吸附。另外(wài)，非特異性吸附的來(lái)源還可能(néng)是分析物中的雜(zá)質，那麽提高(gāo)分析物的純度可能(néng)也(yě)有助于減弱這(zhè)種吸附。

2

改變緩沖液條件抑制吸附的發生。非特異性吸附發生所依賴的作(zuò)用(yòng)力主要就是離子型相互作(zuò)用(yòng)或者疏水(shuǐ)型相互作(zuò)用(yòng)，前者可以通過提高(gāo)離子強度來(lái)抑制，而後者可以通過添加一定濃度的表面活性劑進行屏蔽。常規緩沖液中NaCl濃度在150 mM附近，可以考慮在原運行緩沖液中額外(wài)添加鹽（至~300 mM甚至500 mM）。Cytiva提供含有表面活性劑P20的運行緩沖液，工(gōng)作(zuò)濃度一般爲0.05%。需要注意的是，在提高(gāo)鹽濃度或者加入表面活性劑的過程中，配體與分析物的相互作(zuò)用(yòng)可能(néng)也(yě)會(huì)受到(dào)一定程度的影響。

3

調整分析物的濃度範圍。非特異性吸附往往呈現(xiàn)出非常明(míng)顯的濃度相關性。對(duì)于小(xiǎo)分子分析物，有可能(néng)發生的情況是，當濃度達到(dào)某個值以上(shàng)時(shí)，小(xiǎo)分子的溶解情況出現(xiàn)變化，容易發生聚集沉澱等問題，導緻非特異性吸附的信号陡然上(shàng)升。對(duì)于上(shàng)述情況，可以考慮調整分析物的濃度範圍，将非特異性吸附的信号控制在相對(duì)不顯著的範圍之内進行實驗。當然，分析物的濃度範圍的确定還要考慮KD拟合的需要（如上(shàng)篇中所述），因此這(zhè)個方法不一定能(néng)找到(dào)合适的濃度範圍。

面對(duì)實際出現(xiàn)的非特異性吸附問題時(shí)，往往是以上(shàng)三方面綜合考慮，進而嘗試解決。

至此，關于Biacore檢測蛋白(bái)與小(xiǎo)分子互作(zuò)的實驗進行步驟和(hé)數據分析過程的常見問題也(yě)已分享完畢。一個成功的Biacore實驗需要在實驗設計(jì)、樣品準備以及結果分析等各階段進行問題的排查與調整，檢測蛋白(bái)與小(xiǎo)分子互作(zuò)的實驗中可能(néng)會(huì)出現(xiàn)形形色色的問題，但(dàn)是造成這(zhè)些(xiē)問題的主要原因應該都在這(zhè)兩篇讨論的内容中了(le)，很(hěn)多情況下(xià)未知(zhī)的現(xiàn)象往往是已知(zhī)的原因導緻的。萬變不離其宗，希望這(zhè)上(shàng)下(xià)兩篇的分享能(néng)給大(dà)家帶來(lái)一些(xiē)提示與啓發。

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