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不管是在藥物研發還是基礎科研中,檢測蛋白(bái)與小(xiǎo)分子的相互作(zuò)用(yòng)都是一類重要的實驗。小(xiǎo)分子最主要的特點是分子量較小(xiǎo),一般在1000 Da以下(xià);并且結構性質各異,部分溶解度較差,需要使用(yòng)有機溶劑(例如DMSO等)促溶;這(zhè)些(xiē)特點給相互作(zuò)用(yòng)的檢測帶來(lái)很(hěn)大(dà)的挑戰。基于SPR(表面等離子體共振)原理(lǐ)的Biacore系統具有靈敏度高(gāo)、可進行溶劑校正等優勢,不僅可以檢測較低(dī)的信号,且對(duì)分子量差異懸殊的互作(zuò)類型也(yě)能(néng)精确檢測,同時(shí)還能(néng)消除有機溶劑帶來(lái)的影響,因此越來(lái)越多的研究者選擇Biacore進行蛋白(bái)與小(xiǎo)分子相互作(zuò)用(yòng)檢測。
我們将根據智荟專線收集到(dào)的客戶反饋,針對(duì)Biacore系統檢測蛋白(bái)與小(xiǎo)分子相互作(zuò)用(yòng)實驗中常出現(xiàn)的代表性問題,分上(shàng)下(xià)兩篇進行簡單的分享與讨論。本篇爲上(shàng)篇,将主要圍繞實驗設計(jì)和(hé)樣品準備方面的問題展開(kāi)介紹。
一、配體的固定策略以及芯片的選擇
對(duì)于配體(固定相)采用(yòng)合理(lǐ)的固定方式并達到(dào)所需的固定量,是Biacore實驗邁向成功的第一步。然而所有基于傳感器表面的檢測技術,都會(huì)面臨“物質遷移效應”的影響,所以根據實驗類型及科學的偶聯量計(jì)算(suàn)公式去控制偶聯量非常關鍵。爲此,目前僅有Biacore具備這(zhè)樣嚴謹的計(jì)算(suàn)公式,這(zhè)其中固定量的計(jì)算(suàn)方式主要就是參考以下(xià)核心方程式,并且其不僅适用(yòng)于直接偶聯法的偶聯量計(jì)算(suàn),也(yě)可用(yòng)于捕獲法的捕獲量計(jì)算(suàn):
公式中,RL爲配體的固定量,Rmax爲芯片表面的最大(dà)結合容量,Sm爲化學計(jì)量比(未知(zhī)情況時(shí)可先設爲1)。此公式可以簡單理(lǐ)解爲,Biacore中産生的響應值信号反映的是芯片表面質量的變化。一般情況下(xià),對(duì)于動力學分析,要求Rmax ≤ 50 RU;對(duì)于親和(hé)力分析,要求Rmax ≤ 100 RU。由此計(jì)算(suàn)得到(dào)理(lǐ)論固定量RL,在偶聯法中實際固定量可能(néng)需要1.5~3RL;在捕獲法中,則可以按照理(lǐ)論固定量來(lái)設定配體的捕獲量,因爲捕獲過程的分子朝向固定,條件一般也(yě)是溫和(hé)的接近中性,最大(dà)程度地保留的配體分子的活性。
對(duì)于上(shàng)面的核心方程式有了(le)基本的了(le)解之後,就可以回答(dá)下(xià)面這(zhè)些(xiē)問題了(le)。
1是選擇固定蛋白(bái)還是固定小(xiǎo)分子?
首先需要明(míng)确的是,如果您的實驗目的是想獲得精确的親和(hé)力數值,那建議(yì)選擇固定蛋白(bái)。考慮到(dào)小(xiǎo)分子的固定難度、空(kōng)間位阻以及固定過程對(duì)于結合的影響等方面的問題,選擇氨基偶聯的方式固定蛋白(bái)往往是最簡單、有效的固定方式。而小(xiǎo)分子本身的活性基團有限,基團的反應活性也(yě)與蛋白(bái)存在一定的差異,偶聯條件需要摸索,另外(wài),通過這(zhè)些(xiē)基團的偶聯反應可能(néng)也(yě)破壞了(le)小(xiǎo)分子僅有的結合反應活性位點。因此,隻有對(duì)于某些(xiē)特定類型的定性實驗,比如分子垂釣,固定小(xiǎo)分子也(yě)是可行的,通常推薦的固定方式是使用(yòng)SA芯片固定生物素修飾後的小(xiǎo)分子,可以在比較明(míng)确的條件下(xià)實現(xiàn)穩定的固定,而且生物素分子在一定程度上(shàng)可以起到(dào)間隔臂(spacer arm)的作(zuò)用(yòng),減少小(xiǎo)分子結合受到(dào)的空(kōng)間位阻影響。
綜上(shàng)所述,固定蛋白(bái)的過程相對(duì)簡單也(yě)适用(yòng)于大(dà)多數結合反應,因此是目前探究蛋白(bái)與小(xiǎo)分子互作(zuò)時(shí)最常用(yòng)的選擇。
2固定蛋白(bái)是選擇直接偶聯還是捕獲法?
先說結論:我們建議(yì),進行蛋白(bái)與小(xiǎo)分子互作(zuò)實驗時(shí)優先考慮直接偶聯蛋白(bái)的方式。
直接偶聯(氨基偶聯)法的操作(zuò)方法較簡便、明(míng)确,而且可以實現(xiàn)較高(gāo)的偶聯量,在小(xiǎo)分子作(zuò)爲分析物時(shí),有利于獲得比較理(lǐ)想的響應值。例如常用(yòng)的CM5芯片,最高(gāo)偶聯量可以到(dào)10000 – 15000 RU,非常适合蛋白(bái)與小(xiǎo)分子此類分子量差異懸殊的檢測。除了(le)直接偶聯法以外(wài),根據樣品性質與分子量差異,捕獲法也(yě)是一種您可以選擇的固定策略,例如:待固定的樣品未經純化,含有其他(tā)雜(zá)質;或者擔心直接偶聯的過程會(huì)影響結合位點等。在這(zhè)些(xiē)情況下(xià),可以考慮通過捕獲法固定配體。當配體樣品的純度不夠時(shí),捕獲的過程相當于在芯片表面進行了(le)一次在線純化;捕獲過程的條件較爲溫和(hé),可以盡可能(néng)地保留配體的結合活性,同時(shí)保證配體自(zì)由朝向,充分暴露結合位點。
常用(yòng)的捕獲類芯片以NTA芯片爲例,這(zhè)是一種可以通過螯合鎳離子捕獲帶有His标簽蛋白(bái)的捕獲芯片。如下(xià)圖1所示,NTA芯片上(shàng)捕獲量大(dà)約在3000 – 4000 RU[1]最爲穩定,非常适合His标簽蛋白(bái)與小(xiǎo)分子二者分子量差異不是特别大(dà)的親和(hé)力檢測。
1. 在NTA芯片上(shàng),不同捕獲量水(shuǐ)平下(xià)基線的穩定情況[1]。
3氨基偶聯蛋白(bái)配體是選擇CM5芯片還是CM7芯片?
CM5與CM7芯片表面均爲羧甲基化修飾的葡聚糖基質,兩者最主要的區(qū)别是CM7芯片的羧基含量顯著高(gāo)于CM5芯片,因此可以實現(xiàn)更高(gāo)的偶聯量。圖2比較了(le)三對(duì)蛋白(bái)與小(xiǎo)分子的互作(zuò)在CM5和(hé)CM7芯片上(shàng)的結果差異,可以看(kàn)到(dào)同一組互作(zuò)實驗,在CM7芯片上(shàng)可以達到(dào)的偶聯量和(hé)分析物響應值爲CM5芯片的3倍以上(shàng) [2] 。
2. 三組蛋白(bái)與小(xiǎo)分子互作(zuò)在CM5和(hé)CM7芯片上(shàng)的偶聯量與分析物響應值比較[2]。
如上(shàng)所述,CM5芯片的最高(gāo)偶聯量在10000 – 15000 RU左右,如果按照固定量計(jì)算(suàn)公式得到(dào)的理(lǐ)論偶聯量遠超這(zhè)個範圍,則可以考慮使用(yòng)CM7芯片。簡單來(lái)說,當蛋白(bái)與小(xiǎo)分子的分子量比值大(dà)于100時(shí),就建議(yì)考慮換用(yòng)CM7芯片。
二、樣品準備的相關問題
在确定了(le)配體的固定策略,并選定了(le)相應的芯片之後,就可以開(kāi)始下(xià)一步的實驗了(le)。進入試劑、樣品的準備階段,又會(huì)遇到(dào)哪些(xiē)問題呢(ne)?我們接着往下(xià)看(kàn)。
如何選擇運行緩沖液?
目前Cytiva供應的用(yòng)于Biacore實驗的運行緩沖液主要有兩大(dà)類,分别是基于HEPES緩沖體系的HBS系列緩沖液與基于磷酸鹽緩沖體系的PBS系列緩沖液。
在選擇運行緩沖液時(shí),并沒有明(míng)确的規定必須使用(yòng)何種緩沖液,應該根據分子互作(zuò)的自(zì)身性質選擇合适的緩沖液。一般來(lái)說,有以下(xià)經驗可供參考:當分析物是小(xiǎo)分子的情況下(xià)可以首先嘗試PBS 或者PBS-P+緩沖液;而分析物爲蛋白(bái)時(shí)可以首先嘗試HBS或者HBS-EP+緩沖液。
在一些(xiē)情況下(xià),小(xiǎo)分子的溶解需要一定濃度的有機溶劑助溶,例如5% DMSO等,而這(zhè)些(xiē)有機溶劑在不同樣品之間的濃度差異會(huì)幹擾響應值信号,因此需要對(duì)這(zhè)部分由運行緩沖液造成的信号進行校正——溶劑校正。而有機溶劑自(zì)動校正的功能(néng),也(yě)是Biacore的絕活兒之一,充分保證了(le)最終實驗結果真實可信。關于溶劑校正的相關問題将在下(xià)篇中進行讨論。
需要準備多少的蛋白(bái)用(yòng)來(lái)偶聯?
實驗準備的配體蛋白(bái)量,至少要足夠其達到(dào)所需的偶聯量。下(xià)表展示了(le)要達到(dào)不同的偶聯水(shuǐ)平時(shí)所需的配體濃度以及相應的配體偶聯時(shí)間(流速爲10 μL/min),可供參考[3]。需要注意的是,表中列出的“配體工(gōng)作(zuò)濃度”是用(yòng)偶聯緩沖液醋酸鈉稀釋配體蛋白(bái)樣品後的濃度。爲了(le)讓稀釋後的蛋白(bái)樣品能(néng)夠充分富集在芯片表面,醋酸鈉的稀釋倍數一般要在20倍以上(shàng);如果稀釋倍數不夠,将影響配體蛋白(bái)偶聯效率。因此,準備配體蛋白(bái)母液時(shí)最好(hǎo)在工(gōng)作(zuò)濃度的20倍以上(shàng)。
表1. 偶聯量與配體工(gōng)作(zuò)濃度參考表[3]。
對(duì)于一個未知(zhī)的實驗,摸索合适的偶聯量等過程是必不可少的,因此對(duì)于蛋白(bái)配體的用(yòng)量也(yě)不應僅限于夠一次偶聯實驗使用(yòng)。一般的建議(yì)是,配體蛋白(bái)的準備量在1 mg/mL濃度、50 μL以上(shàng)。但(dàn)即便如此,老(lǎo)師們也(yě)能(néng)清晰的算(suàn)出來(lái)Biacore對(duì)于蛋白(bái)的用(yòng)量非常低(dī),遠遠優于您其他(tā)的互作(zuò)檢測手段。
小(xiǎo)分子分析物的濃度範圍如何确定?
不管在動力學(Kinetics)分析還是在親和(hé)力(Affinity)分析中,分析物濃度範圍的确定均與結合反應的解離平衡常數(KD)有關。一般設置的分析物濃度梯度範圍如果能(néng)夠覆蓋KD值,将會(huì)達到(dào)較準确的拟合結果。在動力學分析中,一個理(lǐ)想的分析物濃度範圍可以從(cóng)10 × KD作(zuò)爲最高(gāo)濃度進行梯度稀釋;在親和(hé)力分析中,理(lǐ)想的分析物濃度範圍可以選擇從(cóng)2 × KD的濃度作(zuò)爲最高(gāo)濃度進行梯度稀釋[4]。對(duì)于蛋白(bái)與小(xiǎo)分子的互作(zuò),大(dà)多數情況下(xià)是“快(kuài)結合快(kuài)解離”的模式,适用(yòng)于親和(hé)力分析的模型(關于數據分析中模型選擇的問題,将會(huì)在下(xià)篇中進行讨論)。蛋白(bái)與小(xiǎo)分子結合反應的KD值,基本都在μM級别,因此可以将小(xiǎo)分子最高(gāo)濃度設爲1000 μM,按照3倍甚至5倍的稀釋比例來(lái)配制濃度梯度(拉大(dà)範圍)。進行這(zhè)樣的初步實驗後,基本可以确定反應KD值的大(dà)緻範圍,後續可以調整濃度範圍、減小(xiǎo)稀釋比例再進行進一步實驗。當然,小(xiǎo)分子能(néng)夠達到(dào)的最高(gāo)濃度還受到(dào)溶解度等因素的影響。
以上(shàng)是針對(duì)Biacore檢測蛋白(bái)與小(xiǎo)分子互作(zuò)的實驗方案設計(jì)以及樣品準備方面的常見問題分享。良好(hǎo)的開(kāi)端是成功的一半,合理(lǐ)的活性配體偶聯量、分析物濃度範圍以及運行緩沖液選擇,将幫助我們得到(dào)更理(lǐ)想的實驗結果。在下(xià)篇中我們将繼續分享關于實驗進行以及數據分析方面的常見問題,敬請(qǐng)期待!
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