近日，中國農(nóng)業科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所王曉鈞團隊在《PLoS Pathogens》雜(zá)志刊載了(le)題爲 「Selective usage of ANP32 proteins by influenza B virus polymerase: Implications in determination of host range」的文(wén)章。該文(wén)章系統性地揭示了(le) B 型流感病毒感染的種間限制機制，發現(xiàn)宿主 ANP32A&B 蛋白(bái)是決定 B 型流感病毒聚合酶活性的須關鍵因子。

甲型流感病毒（IAV）和(hé)乙型流感病毒（IBV）屬于正粘病毒科。禽類作(zuò)爲 IAV 的重要宿主，經常将 IAV 跨物種傳播給哺乳動物。而 IBV 與 IAV 複制機制類似且受體相同，卻少有禽類自(zì)然感染 IBV 的報(bào)道(dào)，這(zhè)說明(míng) IBV 在禽類體内無法複制，但(dàn)具體機制尚不明(míng)确。

圖 2   乙型流感病毒結構示意圖

前期研究已經證明(míng)，宿主 ANP32A&B 蛋白(bái)在  IAV 聚合酶活性中起到(dào)關鍵性作(zuò)用(yòng)，那麽 ANP32 蛋白(bái)是否在 IBV 的複制中也(yě)具有類似的功能(néng)呢(ne)？不同物種的 ANP32 蛋白(bái)是否爲 IBV 提供不同的支持？

研究團隊構建出不同的細胞系，利用(yòng)聚合酶雙熒光報(bào)告系統等技術，獲得重大(dà)發現(xiàn)，其中兩點尤爲突出：

1.ANP32A、ANP32B 對(duì)于 IBV 的複制起主要作(zuò)用(yòng)，ANP32E 的作(zuò)用(yòng)相對(duì)有限；

2.哺乳動物 ANP32A&B 蛋白(bái)可以完全支持 IBV 聚合酶複制，而禽類 ANP32A 由于有 33 個氨基酸的插入以及禽類 ANP32B 由于 129/130 位點的突變，導緻禽類 ANP32A&B 均無法支持 IBV 的複制。

爲進一步探索不同物種 ANP32 蛋白(bái)支持 IBV 聚合酶活性差異的分子機制，該研究利用(yòng) Co-IP，以及基于 Biacore 的表面等離子共振 SPR 等技術進行相關檢測。

Co-IP 實驗結果顯示： huANP32A 和(hé)  chANP32A 對(duì)于 IBV 聚合酶具有相似的結合能(néng)力，但(dàn)無法給出定量的結合差異分析。爲了(le)解決這(zhè)個問題，研究人員使用(yòng) Biacore  對(duì) IBV 聚合酶與 ANP32 蛋白(bái)進行動力學/親和(hé)力表征。

研究人員使用(yòng) CM5 芯片氨基偶聯 Anti-His 抗體自(zì)制 Anti-His 捕獲芯片，随後流經含有 His-IBV 聚合酶的細胞裂解液，捕獲 His-IBV 聚合酶。然後将 ANP32 蛋白(bái)稀釋到(dào)一系列濃度作(zuò)爲流動相，使用(yòng) Biacore T200 對(duì)聚合酶與 ANP32 蛋白(bái)進行動力學/親和(hé)力表征。

實驗結果表明(míng)：與 Co-IP 結果一緻，huANP32A，chANP32A 和(hé) huANP32A + 33 在 0.15625-5μM 的濃度下(xià)均能(néng)與病毒聚合酶結合（圖 4A – 4C）。相反，huANP32A_165T 幾乎不與聚合酶結合（圖 4D）。在另一個僅将兩個聚合酶亞基（PA 和(hé) PB1）固定在 CM5 芯片上(shàng)的對(duì)照實驗中，在 huANP32A 和(hé)病毒聚合酶亞基之間未檢測到(dào)特異性親和(hé)力（圖 4E）。

通過 Biacore 分析計(jì)算(suàn)得出 huANP32A，chANP32A 和(hé) huANP32A+ 33 的解離平衡常數（KD）有着顯著差異。huANP32A 與 IBV 聚合酶結合，KD = 0.05418μM，幾乎比 chANP32A 低(dī) 3 倍。插入 33 個氨基酸的 huANP32A 和(hé)聚合酶結合的 KD 值也(yě)從(cóng) 0.05418μM 增加到(dào) 0.1013μM（圖 4F）。盡管 huANP32A，chANP32A 和(hé) huANP32A + 33 具有相似的解離速率常數（kd），但(dàn)結合速率常數（ka）卻截然不同。huANP32A 與 His-IBV 聚合酶結合的 ka 值是其他(tā)兩種蛋白(bái)質的 ka 值的兩倍。

該結果表明(míng)，與 ChANP32A 相比，huANP32A 對(duì) IBV 聚合酶具有更強的結合親和(hé)力，并且 33 個氨基酸的插入降低(dī)了(le) ANP32A 與 IBV 聚合酶的結合親和(hé)力。

圖 4 IVB 聚合酶與 ANP32 蛋白(bái)互作(zuò) Biacore 結果

該研究揭示了(le)哺乳動物 ANP32 家族蛋白(bái)是支持 IBV 複制的關鍵宿主蛋白(bái)，并明(míng)确了(le)禽類 ANP32 蛋白(bái)無法支持病毒聚合酶活性的分子機制（圖 5）。對(duì)理(lǐ)解 IBV 聚合酶功能(néng)、作(zuò)用(yòng)機理(lǐ)和(hé)宿主範圍決定因素具有重要意義，同時(shí)可爲抗 IBV 藥物靶點設計(jì)和(hé)跨物種傳播的防控提供理(lǐ)論依據。

圖 5 IAV 和(hé) IBV 聚合酶對(duì) ANP32 蛋白(bái)的選擇性使用(yòng)及其分子基礎

縱觀全文(wén)，Biacore 的技術優勢清晰易見

1、Biacore 區(qū)分出不同物種、不同氨基酸結構的同源蛋白(bái)與 IBV 聚合酶相互作(zuò)用(yòng)的細微差異，這(zhè)是 Co-IP 等同類技術所不具備的，充分體現(xiàn)出 Biacore的分辨率。

2、Biacore 互作(zuò)信息，幫助研究人員從(cóng) KD、ka、kd 等方向表征分子相互作(zuò)用(yòng)，定量地闡釋不同分子之間相互作(zuò)用(yòng)的異同點，從(cóng)而幫助科研人員好(hǎo)的闡明(míng)相關的分子機制。

3、利用(yòng) Biacore 可以直接捕獲粗樣品中的目的蛋白(bái)，并進行親和(hé)力動力學的表征。這(zhè)這(zhè)篇文(wén)章中，研究人員利用(yòng) Anti-His 捕獲芯片，能(néng)夠從(cóng)細胞裂解液中直接捕獲 His-IBV 聚合酶，并檢測其與 ANP32 蛋白(bái)的互作(zuò)。這(zhè)樣隻需要純化一種蛋白(bái)即可進行的親和(hé)力動力學表征，降低(dī)了(le)樣品準備時(shí)間與難度。

自(zì) 1990 年上(shàng)市自(zì)今，Biacore 經過 30 年的發展，已經成爲分子互作(zuò)檢測的「金(jīn)标準」，廣泛應用(yòng)到(dào)基礎科研與藥物開(kāi)發的多個領域，累計(jì)發表的文(wén)章已經過四萬篇，過 80% 的上(shàng)市抗體藥物在研發、申報(bào)與生産中都使用(yòng)了(le) Biacore。