01

OD600的應用(yòng)--幫助了(le)解細菌的生長狀态

OD600是指在600nm波長處的吸光值，常常被用(yòng)于分析細菌生長和(hé)進行抗生素敏感性測試，在細菌檢測中，測量波長需要選擇在生物材料吸光度最小(xiǎo)的範圍内。因此，這(zhè)些(xiē)細菌生長曲線測量通常使用(yòng)600-670nm左右的紅(hóng)色波長。在細菌連續培養過程中，在不同的時(shí)間點檢測菌液的OD600值，然後以時(shí)間爲橫坐(zuò)标，OD600爲縱坐(zuò)标，描繪細菌的生長曲線。結合生長曲線，可以評估細菌所處的生長階段，進而可以确定合适的誘導表達或收獲的時(shí)間點。

02

OD600 測量菌液/細胞濃度的原理(lǐ)

細菌密度的測量方式是通過光的散射，也(yě)就是看(kàn)渾濁程度而不是吸光度，光的散射程度反應的是細胞的生物質量而不是細胞個數，也(yě)稱濁度測量。濁度法測量非均質溶液中是否存在固體顆粒。固體顆粒可以是細胞、沉澱、聚集體或溶液中存在的任何其他(tā)固體物質。顆粒會(huì)散射光束中的光子，因此儀器檢測器會(huì)檢測到(dào)較低(dī)的光強度。這(zhè)種現(xiàn)象與吸光度測量截然不同，吸光度測量是指光子被均勻溶液中的特定染料吸收，吸光度和(hé)濁度散射的基本區(qū)别如圖 1 所示。

圖1：吸光度和(hé)濁度散射的基本區(qū)别, 在吸光度測定中，由于光被樣品吸收，光電探測器中的光強會(huì)減弱（A）；在濁度測定中，入射光由樣本中的細胞/粒子随機産生散射。這(zhè)将導緻方向的不确定性。繼續沿直線傳播的光會(huì)進入檢測器，光強也(yě)會(huì)減弱（B）

03

使用(yòng)不同的設備測量OD600細菌濃度可能(néng)得到(dào)不同的數值

對(duì)于具有濁度的樣品，如細菌溶液、細胞培養物，測量的“吸光值”是由于光散射，而不是溶質分子光吸收的結果。由于光散射的程度受系統光學特性(比色池和(hé)儀器出口狹縫之間的距離、單色器光學特性、狹縫幾何特性等)的影響，使用(yòng)不同類型的分光光度計(jì)測量同一樣品時(shí)，可能(néng)會(huì)得到(dào)不同的OD600讀數。

那我們來(lái)看(kàn)下(xià)主要有哪些(xiē)原因影響濁度的測量呢(ne)？

一是濁度測量受樣品中顆粒濃度的影響

濁度測量總是在異質樣品中進行，一般需要測量96/ 384 孔闆，現(xiàn)在多數酶标儀通常使用(yòng)相當窄的測量光束。通常情況下(xià)，微孔闆光度計(jì)的光束直徑不到(dào)一毫米，當光束穿過96孔闆的孔時(shí)，測量光束隻能(néng)覆蓋樣品體積的很(hěn)小(xiǎo)一部分（圖2）。另外(wài)，現(xiàn)代微孔闆光度計(jì)的采樣時(shí)間也(yě)很(hěn)短，通常爲毫秒級，這(zhè)些(xiē)對(duì)于濁度測量來(lái)說并不是最佳選擇會(huì)增加變化。比如液體中的固體顆粒并非處于靜止狀态，而是在整個液體中自(zì)由漂浮。因此，當樣品中隻有少量固體顆粒時(shí)，在重複測量中，相同數量的顆粒出現(xiàn)在光束内的概率很(hěn)低(dī)。如果樣品中有100 個顆粒，那麽測量光束區(qū)域内的顆粒數最有可能(néng)是1個，但(dàn)随機情況下(xià)可能(néng)是0個或2個，甚至3個。當采樣時(shí)間也(yě)以毫秒爲單位時(shí)，液體中顆粒的動态流動不會(huì)明(míng)顯改變單個測量中的這(zhè)種情況。因此,當OD值較低(dī)時(shí)，檢測精度可能(néng)會(huì)明(míng)顯降低(dī)，吸光度檢測的 CVs% 也(yě)會(huì)大(dà)于正常值。

同樣，當樣品中的顆粒數量增加到(dào)非常多時(shí)，從(cóng)顆粒上(shàng)散射的光子會(huì)撞擊到(dào)另一個顆粒并重新散射。這(zhè)将導緻一些(xiē)散射光子經過多次散射後到(dào)達檢測器。因此，濁度測量的線性測量範圍總是低(dī)于吸光度測量。

二是不同儀器分光光度計(jì)的設計(jì)影響濁度測量

吸光度和(hé)濁度測量之間第二個非常重要的區(qū)别是，不同儀器的光學設計(jì)會(huì)影響所得到(dào)的OD值（圖 3）。因此，不同廠(chǎng)家生産的微孔闆光度計(jì)沒法對(duì)同一樣品給出相同的OD值。這(zhè)裏有兩個影響因素：一是光電探測器收集窗口的大(dà)小(xiǎo)，二是收集狹縫的大(dà)小(xiǎo)。探測器窗口越大(dà)，收集到(dào)的輕微散射光子就越多，因此觀測到(dào)的OD 值就越低(dī)。還有一個主要問題是樣品到(dào)檢測器的距離。如果檢測器距離樣品很(hěn)遠，即使是輕微散射光子也(yě)會(huì)到(dào)達檢測器；如果很(hěn)近，即使是強烈散射光子也(yě)會(huì)被檢測器收集到(dào)。因此，這(zhè)個距離對(duì)得出的OD 值影響也(yě)很(hěn)大(dà)。由于每個制造商的光學設計(jì)不同，這(zhè)兩個參數（距離和(hé)探測器的大(dà)小(xiǎo)）在兩台不同的儀器中永遠不會(huì)相同。這(zhè)些(xiē)因素不會(huì)影響吸收測定，因爲在吸收測定中光束形狀保持不變。檢測器的大(dà)小(xiǎo)或距離不會(huì)改變到(dào)達檢測器的光量。

圖示3：檢測器收集窗口的大(dà)小(xiǎo)和(hé)與樣品的距離都會(huì)改變所測得的OD值，因此不同的儀器會(huì)對(duì)相同的樣品給出不同的OD值。檢測到(dào)的OD值差異很(hěn)容易達到(dào)20-40%。

比如下(xià)圖中，在濁度測定結果的偏差表明(míng)，Multiskan Sky 和(hé) SkyHigh 采用(yòng)了(le)非常相似的光學設計(jì)，因此結果幾乎相同，但(dàn)Varioskan LUX 和(hé) Multiskan FC 采用(yòng)了(le)不同類型的光學器件，因此與Sky和(hé)SkyHigh有很(hěn)大(dà)不同，兩者之間也(yě)存在明(míng)顯差異。但(dàn)在吸光度測量方面，所有四款酶标儀的測量結果完全相同。

圖示4：不同型号酶标儀檢測吸光度和(hé)濁度的比較

因此，對(duì)于OD600測量，不同酶标儀的結果不能(néng)直接進行比較。對(duì)于OD600測量，使用(yòng)相同型号的分光光度計(jì)可以保障良好(hǎo)的重複結果。而對(duì)于不同酶标儀的結果首先需要使用(yòng)适當的校準曲線進行标準化。

常規的酶标儀檢測都具備了(le)光吸收檢測功能(néng)，賽默飛(fēi)多款酶标儀具有單獨模塊用(yòng)于濁度檢測，比如單功能(néng)酶标儀FC，配有比色杯模塊的Multiskan SkyHigh 以及多功能(néng)酶标儀Varioskan LUX等，都是核酸、蛋白(bái)質、菌液濃度及其他(tā)物質測量的多功能(néng)儀器，可爲用(yòng)戶提供完善的解決方案。