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來(lái)源：賽默飛(fēi)電子商務平台
01
目标模闆濃度太低(dī)
在qPCR 中體現(xiàn)爲CT值偏大(dà)，複孔重複性不佳。
可能(néng)的原因1
基因表達豐度低(dī)
優化建議(yì)：選擇高(gāo)靈敏度、熒光信号強、更寬動态範圍的qPCR試劑對(duì)付低(dī)豐度模闆；
可能(néng)的原因2
模闆稀釋過度
優化建議(yì)：提高(gāo)模闆濃度(濃縮)，減少模闆稀釋度（理(lǐ)論上(shàng)每稀釋10倍，CT 值大(dà) 3.3）；
可能(néng)的原因3
模闆有降解
優化建議(yì)：重新制備模闆，注意選擇好(hǎo)的RNA純化Kit，避免RNA降解，優化逆轉錄條件。
02
擴增效率異常
擴增效率偏離100%±10% 應考慮優化。Ct值出現(xiàn)太晚的潛在原因之一是擴增效率低(dī)，導緻效率低(dī)的原因可能(néng)有
可能(néng)的原因1
反應條件未優化
優化建議(yì)：可以在同一實驗中預設不同退火溫度，選擇Ct值較小(xiǎo)且平台期熒光強度高(gāo)的那個溫度；
可能(néng)的原因2
存在PCR反應抑制劑
優化建議(yì)：一般反應抑制劑多爲模闆帶入，可考慮重新制備模闆或者稀釋模闆從(cóng)而降低(dī)抑制劑水(shuǐ)平；選擇反應性能(néng)強健、更耐受抑制劑 的試劑有助于減少此類因素影響；
可能(néng)的原因3
模闆擴增區(qū)域有複雜(zá)二級結構，高(gāo)GC含量，影響擴增效率
優化建議(yì)：同一目标設計(jì)多個擴增區(qū)域/避開(kāi)二級結構複雜(zá)的區(qū)域；選擇性能(néng)強健耐受性高(gāo)的預混液，都是可行的解決方法。
03
PCR産物過長影響擴增效率
優化建議(yì)：
縮短PCR産物長度，控制在100 bp-150 bp之内
優化建議(yì)：
嘗試标準的三步擴增提高(gāo)擴增效率
優化建議(yì)：
加長延伸時(shí)間使得反應完全，以提高(gāo)擴增産量
04
無Ct值
可能(néng)的原因1
循環數不夠
優化建議(yì)：一般反應設置爲40個，必要時(shí)可增加到(dào)45個循環；
可能(néng)的原因2
信号采集設置不當
優化建議(yì)：兩步擴增一般将信号采集設置在退火延伸階段，三步擴增程序應當将信号采集設置在72℃延伸階段。探針法通常在退火結束時(shí)或延伸結束時(shí)采集信号。
01
樣本重複性差
優化建議(yì)：
取材部位/處理(lǐ)方式/時(shí)間應嚴謹地保障一緻；選擇穩定可靠的試劑盒進行樣本制備（如RNA純化盡量選離心柱，帶去除gDNA的）、提取後對(duì)RNA的完整度和(hé)純度進行檢驗，減少樣本質量重複性差。
02
技術重複性差
分爲複孔重複性差（複孔之間ΔCt<0.5就算(suàn)重複性良好(hǎo)），不同次跑的闆間重複性差。
排查方向有以下(xià)——
1
模闆濃度低(dī)容易出現(xiàn)複孔重複性差，若同時(shí)Ct值偏大(dà)，可嘗試提高(gāo)模闆量。條件允許的話(huà)，增加複孔數，棄掉偏差大(dà)的值也(yě)好(hǎo)辦法。
2
加樣誤差是同時(shí)影響孔間和(hé)闆間重複性的常見原因。良好(hǎo)的操作(zuò)習慣有助于提高(gāo)實驗重複性，包括：定期校準加樣器能(néng)減少不同時(shí)期之間的加樣體積偏差；選擇預混液能(néng)減少加樣誤差影響孔間重複性；低(dī)吸附耗材能(néng)減少試劑挂壁；穩定的操作(zuò)環境溫度，反應前充分混勻樣品和(hé)試劑和(hé)離心除氣泡避免影響讀數，都有助于減少孔間差異和(hé)闆間差異。注意儀器上(shàng)不同位置的孔溫度一緻性也(yě)可能(néng)影響孔間一緻性。
3
試劑的配液穩定性也(yě)值得重視(shì)。有時(shí)候，配置好(hǎo)的反應闆不一定能(néng)馬上(shàng)上(shàng)機，等待時(shí)長難以确定，導緻闆間誤差過大(dà)——若預混液能(néng)保持足夠長時(shí)間的穩定性，可确定第一個檢測闆的結果與一個檢測闆的結果相匹配，同時(shí)還能(néng)提高(gāo)工(gōng)作(zuò)流程的整體便利性。
4
試劑的批間一緻性是影響重複性、實驗前後可比較性的重要因素。定量PCR反應體積很(hěn)小(xiǎo)且靈敏度高(gāo)，不同批次試劑的痕量偏差都可能(néng)影響結果穩定。盡量選擇同一批次/批号的試劑，選擇信譽可靠、批間一緻性高(gāo)的産品，有助于提高(gāo)實驗重複性和(hé)結果可比較性。
用(yòng)SYBR Green可以通過測熔解曲線來(lái)分析确認反應産物特異性，熔解曲線是随溫度升高(gāo)DNA雙螺旋結構解開(kāi)程度的曲線：單尖峰提示産物隻有一種；多峰則提示有不止一個産物，比如引物二聚體或者非特異擴增。
排查方向有以下(xià)——
02
非特異擴增
排查特征：
電泳檢測；雜(zá)峰Tm值在80℃之後，目标峰之後的多爲非特異擴增；
優化建議(yì)：
引物設計(jì)特異性不好(hǎo)或者模闆質量不佳（如含有基因組污染）都可能(néng)導緻非特異擴增
——建議(yì)考慮重新設計(jì)引物或者重新制備模闆（記得在RNA純化中用(yòng)DNase處理(lǐ)降解gDNA）
另外(wài)，非特異擴增也(yě)可能(néng)來(lái)自(zì)反應退火開(kāi)始前各種非特異延伸，和(hé)“實驗室某個角落or空(kōng)氣中的前任、前前任qPCR” DNA污染！帶有UDG和(hé)dUTP配方設計(jì)的預混液可一步消除掉這(zhè)類非特異産物；再加上(shàng)抗體暫時(shí)封閉酶活的熱啓動設計(jì)，既能(néng)防止退火前的非特異反應，又能(néng)在退火同時(shí)迅速釋放(fàng)酶活，讓反應更快(kuài)速高(gāo)效率。
Tips:
1
熔解曲線不理(lǐ)想還可嘗試兩步法，因爲二步法擴增特異性高(gāo)。
2
單峰Tm值在80℃之前考慮沒有模闆的可能(néng)性
3
單峰不尖要考慮可能(néng)有大(dà)小(xiǎo)接近的非特異擴增
4
Mg2+離子濃度超過3mM以上(shàng)則易形成引物二聚體，選擇一管全包條件已優化的預混液就不用(yòng)考慮
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A
兼顧高(gāo)靈敏度和(hé)高(gāo)特異性：
保障檢測的特異性同時(shí)具有更小(xiǎo)的Ct 值，低(dī)檢出限5拷貝
B
高(gāo)強度熒光信号：
更大(dà)的擴增曲線dRn值，更高(gāo)的平台期熒光信号
C
寬動态範圍：
可在跨6個對(duì)數級動态範圍内進行精準檢測，并确定可靠的線性
D
桌面穩定性高(gāo)：
配置好(hǎo)的qPCR反應體系可以在室溫下(xià)穩定保存72小(xiǎo)時(shí)
E
批間一緻性高(gāo)：
生産過程遵循ISO 9001質量管理(lǐ)體系，保障數據的穩定性和(hé)重複性
F
抗殘留污染：
采用(yòng)UDG和(hé)dUTP配方，杜絕殘留擴增産物污染造成的假陽性結果
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