來(lái)源：以下(xià)文(wén)章來(lái)源于Cytiva思拓凡 ，作(zuò)者Li Yafei

2023年2月25日，中華中醫(yī)藥學會(huì)發布了(le)2022年中醫(yī)藥十大(dà)學術進展。張伯禮院士指出：2022年度中醫(yī)藥十大(dà)學術進展主要呈現(xiàn)的價值，就包括“重視(shì)新技術新方法在中醫(yī)藥中的應用(yòng)”。北京大(dà)學醫(yī)學部曾克武教授和(hé)屠鵬飛(fēi)教授與浙江大(dà)學、大(dà)連醫(yī)科大(dà)學、博奧生物研究團隊憑借“新技術助力中藥功效科學内涵闡釋”共同獲選2022年度中醫(yī)藥十大(dà)學術進展。

中醫(yī)藥研究者中有廣泛的Biacore用(yòng)戶基礎，曾克武教授和(hé)屠鵬飛(fēi)教授團隊的這(zhè)一成果裏自(zì)然也(yě)有Biacore的身影。接下(xià)來(lái)就讓小(xiǎo)編帶您領略Biacore這(zhè)一現(xiàn)代科技，如何與傳統中醫(yī)藥碰撞并融合，從(cóng)而闡釋中藥功效科學的内涵。

天然産物中抗腫瘤活性分子

發現(xiàn)及作(zuò)用(yòng)機制揭示1

腫瘤免疫微環境（Tumor immune microenvironment ，TIME）調控因子IGF2BP1是一種關鍵N6 -甲基腺苷 (m6A) 閱讀蛋白(bái)，識别m6A靶點轉錄物，被認爲是腫瘤治療的潛在靶點。2022年曾克武教授和(hé)屠鵬飛(fēi)教授團隊發表的研究成果中，發現(xiàn)了(le)天然産物葫蘆素B通過結合IGF2BP1發揮抗腫瘤作(zuò)用(yòng)，并且闡釋了(le)作(zuò)用(yòng)機制。

以IGF2BP1爲出發點，作(zuò)者首先發現(xiàn)，在小(xiǎo)鼠H22荷瘤模型中敲低(dī)IGF2BP1，可以通過免疫細胞招募和(hé)降低(dī)TIME中PD-L1的表達來(lái)抑制肝細胞癌的進展。使用(yòng)Biacore 8K，作(zuò)者驗證了(le)IGF2BP1與甲基化單鏈RNA（ss-m6A）的強親和(hé)力，達到(dào)了(le)18.3 nM。并且發現(xiàn)，IGF2BP1與非甲基化RNA（ss-A）的親和(hé)力則低(dī)了(le)13倍。

确定了(le)治療靶點之後，作(zuò)者使用(yòng)Biacore 8K，直接從(cóng)包含889種化合物的中藥天然産物庫中篩選能(néng)抑制IGF2BP1與其m6A靶點的活性分子。通過合成生物素标記的ss-m6A，作(zuò)者将RNA直接固定在芯片上(shàng)，将化合物固定濃度（20 μM）與IGF2BP1預孵育，檢測RNA與化合物- IGF2BP1的結合信号，從(cóng)而直接篩選出具有抑制效果的天然産物（圖1）。

圖1：Biacore 8K抑制劑篩選方法示意圖

通過Biacore 8K的高(gāo)通量抑制劑篩選實驗，作(zuò)者得到(dào)了(le)抑制劑篩選的排序。從(cóng)圖2中可以直觀看(kàn)出，六種具有較強抑制效果的天然産物被發現(xiàn)，其中抑制效果最強的當屬葫蘆素B（CuB）。在Huh增殖抑制實驗中，葫蘆素B同樣表現(xiàn)出了(le)抑制作(zuò)用(yòng)，72h時(shí)的IC50達到(dào)1.0 uM。

圖2：Biacore 8K抑制劑篩選結果

高(gāo)通量篩選+精确表征，在藥物研究的各個階段都少不了(le)Biacore。在篩選得到(dào)葫蘆素B後，作(zuò)者當然同樣使用(yòng)Biacore精确表征了(le)IGF2BP1與葫蘆素B的親和(hé)力。結果發現(xiàn)，二者的親和(hé)力達到(dào)了(le)1.2 μM，與細胞實驗相互印證（圖3）。

圖3：Biacore精确表征IGF2BP1與CuB的親和(hé)力

葫蘆素B又是什(shén)麽呢(ne)？

葫蘆素B是從(cóng)葫蘆科等植物中分離得到(dào)的一類四環三萜類化合物，具有廣泛的藥理(lǐ)活性。以葫蘆素B爲主要成分的葫蘆素制劑在臨床治療濕熱毒盛所緻的遷延性肝炎、肝硬化和(hé)原發性肝癌具有确切療效。中藥研究，除了(le)根據已知(zhī)靶點從(cóng)天然産物庫中找活性分子外(wài)，另一個角度則是已知(zhī)活性分子，尋找作(zuò)用(yòng)靶點。在通過抑制劑篩選及表征，從(cóng)靶點IGF2BP1出發找到(dào)活性分子葫蘆素B後，作(zuò)者使用(yòng)“鈎釣”的方法，驗證是否能(néng)利用(yòng)葫蘆素B“鈎”出靶點IGF2BP1。

作(zuò)者首先合成了(le)葫蘆素B分子探針，然後利用(yòng)pull-down + 質譜的方法從(cóng)Huh細胞裂解液中成功“鈎”到(dào)了(le)靶點IGF2BP1，并且在免疫熒光共定位實驗中證明(míng)了(le)細胞中葫蘆素B與IGF2BP1的結合。至此，不論是從(cóng)靶點出發找活性分子，還是從(cóng)活性分子出發找靶點，雙管齊下(xià)，作(zuò)者明(míng)确了(le)葫蘆素B與腫瘤免疫微環境調控因子IGF2BP1的直接結合。

爲了(le)進一步闡釋葫蘆素B的抗腫瘤機制，作(zuò)者研究了(le)IGF2BP1上(shàng)葫蘆素B的結合位置及結合方式。将IGF2BP1的結構域逐一删除後，作(zuò)者發現(xiàn)隻有缺失了(le)C端KH結構域會(huì)使IGF2BP1與葫蘆素B不能(néng)結合。通過質譜、pull-down、BLAST、CD等多種方法，作(zuò)者最終确定，葫蘆素B通過邁克爾加成反應結合在IGF2BP1中KH1−2結構域的Cys253上(shàng)，并且會(huì)引起IGF2BP1的構象變化。

那麽葫蘆素B又是如何影響IGF2BP1的功能(néng)呢(ne)？

IGF2BP1本身會(huì)與ss-m6A結合，前面作(zuò)者使用(yòng)Biacore做了(le)二者抑制劑的高(gāo)通量篩選，得到(dào)了(le)葫蘆素B。高(gāo)通量抑制劑篩選能(néng)做，單獨的抑制劑表征當然手到(dào)擒來(lái)。作(zuò)者設置了(le)Biacore實驗來(lái)從(cóng)生化角度上(shàng)表征葫蘆素B的抑制效果。從(cóng)結果可以看(kàn)出，随着葫蘆素B的濃度逐漸提高(gāo)，IGF2BP1與ss-m6A的結合信号越來(lái)越低(dī)（圖4）。Biacore結果與RNA pull-down實驗一緻，明(míng)确了(le)葫蘆素B可以抑制二者結合。

圖4：Biacore實驗明(míng)确葫蘆素B抑制IGF2BP1與ss m6A的結合

後續作(zuò)者還發現(xiàn)，葫蘆素B可以降低(dī)與IGF2BP1所結合的mRNA（包括c-MYC、KRAS 等mRNAs）穩定性，在體内通過誘導細胞凋亡，招募免疫細胞到(dào)腫瘤微環境，阻斷PD-L1的表達，最終表現(xiàn)出明(míng)顯的抗腫瘤效果（圖5）。

圖5：文(wén)章主要研究路線及作(zuò)用(yòng)機制概述

曾克武教授和(hé)屠鵬飛(fēi)教授團隊專注于天然活性分子治療各類型重大(dà)疾病的發現(xiàn)及機制闡釋，開(kāi)發了(le)包括分子探針、蛋白(bái)芯片2在内的多種靶點“鈎釣”技術，多年以來(lái)，許多研究成果中均使用(yòng)了(le)Biacore作(zuò)爲生物分子相互作(zuò)用(yòng)檢測技術。中國科學院院士陳凱先教授指出：年度的學術進展是中醫(yī)藥學術研究的“指南針”和(hé)“風(fēng)向标”。相信此次研究成果的入選，也(yě)将爲廣大(dà)中醫(yī)藥研究者提供更多研究思路，對(duì)“積極推進中醫(yī)藥科研和(hé)創新，推動傳統中醫(yī)藥和(hé)現(xiàn)代科學結合”有重要意義。

Biacore

作(zuò)爲現(xiàn)代化的體外(wài)分子互作(zuò)“金(jīn)标準”，以其超高(gāo)的靈敏度，超高(gāo)的數據質量，無分子量檢測下(xià)限，适用(yòng)于各類型的天然産物及生物分子研究，在中醫(yī)藥研究者中有廣泛的用(yòng)戶基礎。Biacore将持續與廣大(dà)中醫(yī)藥研究者勠力同心，共同推動中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究和(hé)應用(yòng)。

Biacore，for a better life

參考文(wén)獻：

[1] Liu Y ,  Guo Q ,  Yang H , et al. Allosteric Regulation of IGF2BP1 as a Novel Strategy for the Activation of Tumor Immune Microenvironment[J].  2022.

[2] Zhang et al. Neuroinflammation inhibition by small-molecule targeting USP7 noncatalytic domain for neurodegenerative disease therapy, Sci. Adv. 8, eabo0789 (2022)