近日
北京市自(zì)然科學基金(jīn)
資助的重點研究專題項目
“超高(gāo)分辨冷凍電子顯微鏡
成像方法研究與應用(yòng)”
在該項目支持下(xià)，北京大(dà)學毛有東教授團隊于2022年4月27日在國際學術期刊Nature雜(zá)志在線發表了(le)題爲“USP14-regulated allostery of the human proteasome by time-resolved cryo-EM”的研究論文(wén)，闡明(míng)了(le)原子水(shuǐ)平人源蛋白(bái)酶體動力學調控和(hé)構象重編程機制，并在國際上(shàng)展示了(le)人工(gōng)智能(néng)四維重建技術用(yòng)于大(dà)幅提升時(shí)間分辨冷凍電鏡分析精度。
蛋白(bái)酶體功能(néng)紊亂與人體多種疾病相關，如癌症、神經退行性疾病和(hé)免疫疾病等。蛋白(bái)酶體是美(měi)國FDA批準的多種治療癌症的上(shàng)市小(xiǎo)分子藥物的直接靶标。
在正常細胞中，蛋白(bái)酶體的功能(néng)受到(dào)多個水(shuǐ)平的嚴格調控。去泛素化酶USP14是主要的蛋白(bái)酶體調控分子，被認爲是一個潛力大(dà)的治療癌症和(hé)神經退行性疾病的重要靶标，其小(xiǎo)分子抑制劑曾進入過美(měi)國一期臨床研究，但(dàn)圍繞USP14功能(néng)機制的一系列懸而未決的關鍵問題限制了(le)其靶向藥物分子的開(kāi)發和(hé)臨床應用(yòng)。USP14通過結合26S而被激活，然後以毫秒的時(shí)間尺度剪切底物上(shàng)的泛素鏈。它是如何被蛋白(bái)酶體激活并調控蛋白(bái)酶體功能(néng)的，一直是研究機構和(hé)生物制藥領域期待解決的關鍵科學問題。生命分子機器通過複雜(zá)的非平衡動力學過程和(hé)結構變化來(lái)實現(xiàn)其特殊功能(néng)，這(zhè)一過程進而受到(dào)各種複雜(zá)分子間相互作(zuò)用(yòng)的精準調控。如何在原子水(shuǐ)平直接觀察天然态超大(dà)分子機器的功能(néng)态動力學過程，給現(xiàn)有的原子結構動态分析技術提出了(le)挑戰。毛有東教授實驗室長期緻力于發展基于冷凍電鏡的動力學重建方法，圍繞蛋白(bái)酶體、炎症小(xiǎo)體等具有重大(dà)臨床應用(yòng)前景的靶點系統的結構功能(néng)、動力學機制和(hé)靶向調控分子設計(jì)深入開(kāi)展交叉研究。課題組前期的系列工(gōng)作(zuò)揭示了(le)蛋白(bái)酶體的原子架構、組裝原理(lǐ)和(hé)降解泛素化底物的動力學基本規律。
本研究課題進行之初，首先要克服的問題就是“時(shí)間分辨”。蛋白(bái)酶體降解底物的過程是很(hěn)快(kuài)的，時(shí)間尺度在毫秒至秒之間。正常條件下(xià)，想要通過冷凍電鏡技術捕獲此過程的中間态結構，是非常困難的。所以，課題組首先要讓這(zhè)個過程慢下(xià)來(lái)。通過大(dà)量的條件摸索，重建反應動力學體系和(hé)優化反應條件，包括優化緩沖體系、反應溫度等條件，課題組優化出較爲可行的實驗方案，從(cóng)而使得時(shí)間分辨冷凍電鏡技術應用(yòng)成爲可能(néng)，獲得了(le)含時(shí)的45,193張USP14-26S複合體降解泛素底物過程中的冷凍電鏡透射圖樣，挑取了(le)3,556,806個USP14-26S-泛素底物複合體的顆粒圖像。
接下(xià)來(lái)面臨的極端挑戰就是“三維分類”，冷凍電鏡捕獲的複合體圖像需要經過一系列的分類，将它們歸爲不同的構象類别，才能(néng)呈現(xiàn)出蛋白(bái)反應的動态過程。USP14結合到(dào)26S蛋白(bái)酶體後，使得降解底物的動力學過程更加複雜(zá)，想要在如此多的異構複合體顆粒圖像中，鑒别出降解過程的各個時(shí)态的高(gāo)分辨率非平衡構象，傳統的三維分類方法是無法實現(xiàn)的。低(dī)精度的三維分類将導緻低(dī)分辯的三維重建，從(cóng)而無法獲取原子水(shuǐ)平的動力學信息，無法對(duì)含時(shí)的數據賦予自(zì)洽的動态變化的物理(lǐ)意義。課題組結合經過數年自(zì)主開(kāi)發的新型深度學習高(gāo)精度三維分類和(hé)四維重建方法，捕獲了(le)USP14-26S複合體降解多泛素化底物過程的13種不同功能(néng)中間狀态的高(gāo)分辨率（3.0~3.6埃）非平衡構象，通過時(shí)間分辨冷凍電鏡分析，重建了(le)受控蛋白(bái)酶體的完整動力學工(gōng)作(zuò)周期，并結合分子生物學功能(néng)和(hé)基因突變研究，闡明(míng)了(le)USP14和(hé)26S相互調控活性的原子結構基礎和(hé)非平衡動力學機制。研究發現(xiàn)USP14的活化同時(shí)依賴于泛素識别和(hé)蛋白(bái)酶體RPT1亞基的結合。出人意料的是，USP14通過别構效應，誘導蛋白(bái)酶體同時(shí)沿着兩條并行狀态轉變路徑發生構象變化；課題組成功捕獲到(dào)了(le)底物降解中間狀态向底物抑制中間狀态的瞬時(shí)轉化。在底物降解途徑中，USP14活化變構地重編程AAA-ATP酶馬達的構象景觀（Conformational landscape）和(hé)統計(jì)分布，并刺激20S底物通道(dào)的打開(kāi)，從(cóng)而觀察到(dào)底物持續轉運過程的ATPase六聚馬達非對(duì)稱ATP水(shuǐ)解和(hé)近乎完整的全周循環周期。USP14-ATPase的動态相互作(zuò)用(yòng)，使得ATPase馬達底物識别與26S自(zì)身的去泛素化酶RPN11催化發生去耦合效應，并在26S的泛素識别、底物的起始易位和(hé)泛素鏈回收過程中引入三個調控檢查點（動力學分岔點）。這(zhè)些(xiē)發現(xiàn)爲USP14調節26S的完整功能(néng)周期提供了(le)新的高(gāo)分辨見解，并爲USP14靶向藥物治療發現(xiàn)奠定了(le)極爲重要的機制基礎。
圖2. 通過時(shí)間分辨冷凍電鏡分析獲取的USP14調控蛋白(bái)酶體底物降解的并行路徑模型。（Youdong Mao, CC BY 4.0）
這(zhè)是将人工(gōng)智能(néng)四維重建技術用(yòng)于提升時(shí)間分辨冷凍電鏡分析精度，針對(duì)重大(dà)疾病靶蛋白(bái)複合體，實現(xiàn)原子水(shuǐ)平功能(néng)動力學觀測的國際原創成果，展示了(le)一類新型的蛋白(bái)質複合動力學研究範式。Nature同期在線發表了(le)專欄推介文(wén)章，評價該成果是一項重大(dà)研究，解決了(le)原子水(shuǐ)平USP14（泛素特異性肽酶14）活化和(hé)其調控蛋白(bái)酶體功能(néng)的機制問題。
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https://doi.org/10.1038/s41586-022-04671-8
轉載：江西立康公衆号 鏈接：https://mp.weixin.qq.com/s/QUyfgibh3gADVPyZQsaPSg
