上(shàng)一期小(xiǎo)賽給大(dà)家分享了(le)一篇KingFisher純化細胞的文(wén)章，獲得了(le)很(hěn)多小(xiǎo)夥伴的關注，這(zhè)次小(xiǎo)賽又給您帶來(lái)了(le)一篇KingFisher做蛋白(bái)純化的文(wén)章，KingFisher儀器不僅能(néng)用(yòng)于新冠病毒的檢測，還能(néng)用(yòng)于新冠藥物靶點的研究。

2020年5月，一篇名爲 “A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing” 的重磅論文(wén)在Nature上(shàng)發表，推動治療新冠藥物的研發進程。論文(wén)通過揭示SARS-CoV-2病毒與人類蛋白(bái)相互作(zuò)用(yòng)（protein–protein interaction, PPI）的圖譜來(lái)揭示病毒如何劫持細胞系統，找到(dào)了(le)332個SARS-CoV-2蛋白(bái)與人類蛋白(bái)質之間的相互作(zuò)用(yòng)關系，并鑒定出69種能(néng)靶向幹擾的化合物。這(zhè)項研究無論對(duì)于“老(lǎo)藥新用(yòng)”治療新冠疾病，還是對(duì)于指明(míng)新藥的研發方向，都有重要的意義。

值得一提的是

科學家在研究中使用(yòng)了(le)全自(zì)動純化系統KingFisher Flex (Thermo Fisher Scientific) 和(hé)質譜分析儀Q Exactive Orbitrap Mass Spectrometers (Thermo Fisher Scientific) 來(lái)實現(xiàn)親和(hé)純化質譜（affinity purification mass spectrometry，AP-MS），找到(dào)了(le)藥物靶點，爲新冠藥物開(kāi)發助力。

研究方法

他(tā)們首先單獨研究了(le) 29 種 SARS-CoV-2 蛋白(bái)中的 26 種（表1）。

表1. SARS-CoV-2蛋白(bái)表，包括分子質量、與SARS-CoV同源物的序列相似性以及基于SARS-CoV同源物的推斷功能(néng)。

如何找到(dào)這(zhè)26種病毒蛋白(bái)會(huì)與人體裏的哪些(xiē)蛋白(bái)産生相互作(zuò)用(yòng)呢(ne)？

研究人員利用(yòng)在 HEK293T/17 細胞中表達的病毒蛋白(bái)進行親和(hé)純化質譜（AP-MS）。SARS-CoV-2 病毒蛋白(bái)經過密碼子優化并克隆到(dào)帶有親和(hé)标簽（或誘餌）的哺乳動物表達載體中。在宿主細胞中表達這(zhè)些(xiē)病毒蛋白(bái)後，通過高(gāo)通量的純化系統KingFisher Flex，在與宿主蛋白(bái)相互作(zuò)用(yòng)的背景下(xià)純化病毒蛋白(bái)并通過多次純化洗滌，盡量避免雜(zá)蛋白(bái)的幹擾。結合質譜分析得到(dào)的數據，生成SARS-CoV-2蛋白(bái)和(hé)人類蛋白(bái)之間的 PPI 圖譜（圖1）。

圖1. AP-MS鑒定SARS-CoV-2宿主蛋白(bái)-蛋白(bái)質相互作(zuò)用(yòng)的實驗流程。

根據這(zhè)些(xiē)蛋白(bái)相互作(zuò)用(yòng)的數據，科學家們在已經批準的藥物、正在臨床試驗的藥物、以及尚未進入臨床試驗的化合物中，尋找能(néng)夠選擇性幹擾病毒蛋白(bái)-人類蛋白(bái)相互作(zuò)用(yòng)的分子。

爲了(le)進一步證明(míng)藥物的抗病毒性，研究團隊與兩個正在實驗室中處理(lǐ) SARS-CoV-2 病毒的研究小(xiǎo)組合作(zuò)，在 Vero 細胞培養病毒檢測中測試病毒。

主要發現(xiàn)1

繪制SARS-CoV-2病毒蛋白(bái)與人體蛋白(bái)相互作(zuò)用(yòng)網絡

研究團隊首次系統分析了(le)SARS-CoV-2在感染過程中可能(néng)與哪些(xiē)人類蛋白(bái)質相互作(zuò)用(yòng)。用(yòng)親和(hé)純化質譜法（AP-MS）對(duì)27個标記的病毒蛋白(bái)（26種新冠病毒蛋白(bái)和(hé)1種突變體蛋白(bái)）進行分析，基于蛋白(bái)質之間的相互作(zuò)用(yòng)，确定新冠蛋白(bái)與人類蛋白(bái)質的作(zuò)用(yòng)關系，并鑒定了(le)332種高(gāo)置信度新冠蛋白(bái)-人類蛋白(bái)相互作(zuò)用(yòng)網絡（圖2）。

圖2. SARS-CoV-2蛋白(bái)-蛋白(bái)相互作(zuò)用(yòng)網絡。26種SARS-CoV-2蛋白(bái)(紅(hóng)色菱形)與人類蛋白(bái)(圓形;藥物靶點:橙色;蛋白(bái)複合物:黃色;同一生物過程中的蛋白(bái)質:藍色)之間332種具有高(gāo)置信度的相互作(zuò)用(yòng)。

爲了(le)進一步驗證互作(zuò)蛋白(bái)，研究團隊研究了(le)人類相互作(zuò)用(yòng)蛋白(bái)的生物學功能(néng)、解剖表達模式、SARS-CoV-2感染期間的表達變化以及與宿主-病原體相互作(zuò)用(yòng)蛋白(bái)的其他(tā)圖譜。科學家發現(xiàn)這(zhè)些(xiē)新冠病毒蛋白(bái)參與基因調控、信号轉導、應激反應等多個關鍵細胞進程。約40%蛋白(bái)互作(zuò)蛋白(bái)與内室或者囊泡運輸途徑有關。其中新冠病毒會(huì)對(duì)多條先天免疫系統通路如幹擾素通路和(hé) NF-κB通路等産生負面影響。此外(wài)，兩個調節抗病毒先天免疫信号通路的人類蛋白(bái)，也(yě)會(huì)被新冠病毒蛋白(bái)所靶向和(hé)針對(duì)。

主要發現(xiàn)2

篩選幹預蛋白(bái)相互作(zuò)用(yòng)網絡的現(xiàn)有藥物

通過研究蛋白(bái)互作(zuò)，科學家找到(dào)了(le)這(zhè)些(xiē)潛在的藥物靶點。通過整理(lǐ)這(zhè)些(xiē)會(huì)與新冠蛋白(bái)相互作(zuò)用(yòng)的蛋白(bái)信息，科學家們對(duì)比FDA的數據，在已經批準的藥物、正在臨床試驗的藥物、以及尚未進入臨床試驗的化合物中，找到(dào)了(le)69個能(néng)夠選擇性幹擾新冠蛋白(bái)與人類蛋白(bái)相互作(zuò)用(yòng)的化合物（圖3）。在這(zhè)69種化合物中，27種爲已經通過FDA批準上(shàng)市的藥物，另外(wài)還有14種藥物目前還處于臨床研究階段，剩餘28種還未進入臨床研究。

圖3. 藥物和(hé)人類靶點的網絡。圖中顯示了(le)SARS-CoV-2毒餌與已批準藥物(綠色)、臨床候選藥物(橙色)和(hé)臨床前候選藥物(紫色)的蛋白(bái)-蛋白(bái)相互作(zuò)用(yòng)，以及針對(duì)宿主蛋白(bái)(白(bái)色背景)或已知(zhī)宿主因子(灰色背景)的實驗活動。

是否這(zhè)69種化合物都具有抗病毒活性呢(ne)？爲了(le)在體外(wài)測試這(zhè)些(xiē)藥物，他(tā)們在紐約和(hé)巴黎做了(le)病毒感染性實驗（圖4）。在紐約西奈山醫(yī)院，他(tā)們開(kāi)發了(le)一種中通量免疫熒光技術分析(檢測病毒NP蛋白(bái))篩選37種化合物，研究Vero E6細胞系SARS-CoV-2感染的抑制作(zuò)用(yòng)；在法國的巴斯德研究所，另一批科學家通過PCR (RT-qPCR)檢測44種藥物和(hé)化合物。這(zhè)兩個實驗發現(xiàn)了(le)兩類分子能(néng)減少病毒的感染性：mRNA 翻譯抑制劑和(hé) Sigma1 和(hé) Sigma2 受體的預測調節因子。後續研究表明(míng)，這(zhè)些(xiē)分子作(zuò)用(yòng)于病毒入侵細胞之前，可以起到(dào)阻斷病毒感染的作(zuò)用(yòng)。

圖4. 病毒感染性試驗示意圖。

爲了(le)理(lǐ)解這(zhè)些(xiē)抑制劑發揮抗病毒作(zuò)用(yòng)的機制，科學家進行了(le)時(shí)間過程實驗，在感染前或感染後不同時(shí)間添加藥物。結果顯示（圖5）PB28、佐他(tā)替芬 (Zotatifin) 和(hé)羟基氯喹均降低(dī)了(le)病毒的檢出，此外(wài)，這(zhè)三種分子在病毒侵入後的感染後4小(xiǎo)時(shí)内均能(néng)抑制NP的表達。因此，這(zhè)些(xiē)分子似乎在病毒複制過程中發揮其抗病毒作(zuò)用(yòng)。

圖5. 感染前後添加藥物的抗病毒作(zuò)用(yòng)區(qū)别。在添加高(gāo)滴度病毒(MOI = 2)之前或之後添加藥物，抗病毒效果相似。

在本研究中，KingFisher Flex幫助研究人員解決了(le)以下(xià)問題：

1. 純化的均一性。96通量蛋白(bái)樣本在親和(hé)純化時(shí)在同一條件下(xià)完成，實驗更嚴謹。

2. 提高(gāo)實驗效率。AP-MS實驗涉及大(dà)量的标簽蛋白(bái)純化，全自(zì)動純化系統KingFisher Flex代替手工(gōng)操作(zuò)，節約時(shí)間，可重複性強。

3. 實驗準确性。多檔速度可調搭配高(gāo)吸附磁珠，實驗過程中，盡可能(néng)多的标簽蛋白(bái)被純化出來(lái)，提高(gāo)藥物靶點研究的準确性。

參考文(wén)獻

David E. Gordon, Gwendolyn M. Jang, et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature 2020, 583, 459–468