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微量分光光度計(jì)主要用(yòng)于核酸及蛋白(bái)質的濃度測定和(hé)純度評估。然而,在實際應用(yòng)中,經常會(huì)出現(xiàn)核酸較容易被準确測量,而蛋白(bái)質樣品的濃度測量偏差較大(dà)的情況。很(hěn)多用(yòng)戶也(yě)困惑于此,同樣是基于紫外(wài)吸收的檢測,爲何兩種樣品的檢測性能(néng)會(huì)有差異呢(ne)?
坊間也(yě)時(shí)常出現(xiàn)一些(xiē)說法:微量隻能(néng)用(yòng)于測核酸,而蛋白(bái)測不準。如果真是這(zhè)樣的話(huà),那麽設備的使用(yòng)率就會(huì)大(dà)打折扣了(le)。傳聞是不可輕信的,我們還是需要了(le)解原因,然後才能(néng)找出解決方案。
先上(shàng)一組數據看(kàn)看(kàn)
重複性和(hé)穩定性是評判設備性能(néng)的好(hǎo)方式,這(zhè)三台基礎型Nanophotometer® N50T機型在正确的操作(zuò)下(xià),對(duì)較低(dī)濃度和(hé)較高(gāo)濃度樣品的測量,都能(néng)夠得到(dào)一緻的結果,CV<0.4%。如果設備性能(néng)都如此,那前面所述的問題就不存在了(le)。
普遍問題:蛋白(bái)樣品表面張力的影響
蛋白(bái)質樣品,相較于核酸而言,更容易出現(xiàn)表面張力降低(dī)的情況。因此,如果你(nǐ)的微量分光光度計(jì)是采用(yòng)樣品拉伸原理(lǐ)的,即形成液柱的方法,對(duì)于一些(xiē)樣品而言,是難以進行測量的,這(zhè)可能(néng)是造成測量準确性和(hé)重複性不好(hǎo)的大(dà)原因。
01
影響因素一:溫度和(hé)揮發
通常來(lái)說,液體的溫度升高(gāo),由于分子間引力減弱,表面張力會(huì)随之降低(dī)。這(zhè)也(yě)解釋了(le)爲何低(dī)溫保存的核酸樣品,張力較大(dà),更易形成液柱。在夏天實驗環境較熱,或者制藥用(yòng)戶的恒溫恒濕實驗室,溫度是相對(duì)較高(gāo)的,張力會(huì)随之下(xià)降。
等一下(xià),不是有空(kōng)調嗎?空(kōng)調産生的氣流會(huì)大(dà)幅增加微量液體的揮發,暴露在空(kōng)氣中的液柱易受到(dào)影響,對(duì)測量重複性影響較大(dà)。結果就是:房間熱易揮發,冷風(fēng)吹也(yě)易揮發。
02
影響因素二:鹽
無機鹽作(zuò)爲一種非表面活性劑,具有水(shuǐ)合作(zuò)用(yòng),趨向于把水(shuǐ)分子拖入水(shuǐ)中,因此會(huì)增大(dà)表面張力,反之亦然。因此,脫鹽或低(dī)鹽的樣品,表面張力會(huì)降低(dī),常見于蛋白(bái)純化的流程。例如在進行蛋白(bái)質結構分析或質譜分析時(shí),樣品需經過脫鹽處理(lǐ),這(zhè)樣的樣品在進行濃度測量時(shí),并不容易形成液柱。
03
影響因素三:表面活性劑
蛋白(bái)提取過程中經常使用(yòng)的表面活性劑(清潔劑),如SDS、Triton X100,以及在發酵過程中加入的消泡劑等成份,會(huì)大(dà)幅降低(dī)樣品的表面張力(想想看(kàn),連維持泡沫的張力都沒有了(le)),這(zhè)些(xiē)物質常會(huì)殘留在樣本中,難以完全去除。因此,在工(gōng)藝過程中測量蛋白(bái)樣品,是一項挑戰。
04
影響因素四:固液接觸表面
當使用(yòng)移液器将微量樣品加載到(dào)點樣台後,會(huì)出現(xiàn)液體與固體的接觸表面,點樣台表面的親水(shuǐ)/疏水(shuǐ)性質會(huì)影響液體的表面張力。因此,使用(yòng)拉伸法的主流品牌微量分光光度計(jì),點樣台表面具有疏水(shuǐ)性塗層,會(huì)增大(dà)液體的張力。但(dàn)是,随着使用(yòng)損耗,塗層會(huì)逐漸消耗,需要定期使用(yòng)試劑進行維護和(hé)再生。在正确的維護之後,這(zhè)一影響因素也(yě)随之消失,但(dàn)也(yě)增加了(le)維護成本,而大(dà)多數用(yòng)戶并不知(zhī)道(dào)這(zhè)一點。
這(zhè)麽麻煩?我還測不測了(le)!
我們換個思維,如果一台微量分光光度計(jì)的測量原理(lǐ),并不依賴于液體的表面張力呢(ne)?Implen就可以,采用(yòng)樣品壓縮技術的Nanophotometer®檢測時(shí)無需形成液柱,而是将液滴壓縮爲很(hěn)薄的液膜。因此,無論核酸、蛋白(bái),都可以使用(yòng)Nanophotometer®輕松測量。而封閉式的檢測環境,也(yě)很(hěn)好(hǎo)的保護了(le)樣品免受揮發影響。
無論是純化蛋白(bái)、總蛋白(bái)、結合蛋白(bái)、還是肽段樣品,Nanophotometer®都有豐富的APP程序和(hé)方法學應用(yòng),以及我們的技術團隊提供的支持,使您在蛋白(bái)濃度測量中遇到(dào)的問題迎刃而解。